三代测序是指单分子测序技术（Single Molecule Real- Time, SMRT），在测序过程中不需要涉及PCR扩增，不仅实现了每一条DNA分子的单独测序，并且避免了潜在的PCR扩增错误和偏好性。
目前，三代测序技术原理分为单分子荧光测序和纳米孔测序两大阵营，其代表公司分别为Pacific Bioscience和Oxford Nanopore Technologies。现在市场接受度和使用度最高的是Pacific Bioscience三代测序仪，其SMRT技术建立在两项革命性的发明基础之上，从而克服了测序领域的重大挑战。

一.PacBio单分子荧光测序

一.基本原理

第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

第一，零模波导孔技术（Zero-Mode Waveguides，ZMWs）让光只能照亮固定了单个DNA聚合酶／模板分子的纳米孔底部。

因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]（零模波导孔），单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止。

第二，不同荧光分子标记核苷酸磷酸基团可帮助固定的DNA聚合酶完成一个全天然的DNA链合成过程。

PacBio的测序实现中,创造性地将不同荧光分子标记在了各种碱基类型磷酸基团上,标记在磷酸基团上的荧光分子可以最大限度上减少其对核酸合成过程的影响,消除测序的负面影响，从而提高测序的准确性。

另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%,但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。

与二代测序一样，PacBio三代测序的第一步也是建库，其主要区别是建库过程不涉及PCR反应。DNA分子打断之后，经过修复、接头连接、纯化和聚合酶绑定，即可出库准备上机测序。

二.HIFI模式

PacBio提供高度准确的长读长的测序技术（HiFi Reads），在读长达到15-20 kb的情况下，可提供Sanger测序相当的准确度（> 99％），满足组装复杂基因组的需要，可检测从单核苷酸突变到结构变异的各种基因组变异。HiFi reads（High fidelity reads）是PacBio公司基于Sequel II平台推出的CCS（Circular Consensus Sequencing）测序模式产生的兼具长读长和高准确度的测序序列，又称CCS reads。在这种测序模式下，因酶读长（平均90-100 Kb）远大于插入片段长度（10-20 Kb），测序时，聚合酶会绕着DNA模板进行环形比对测序，使得插入片段被多次测序，产生多条subreads，来源于同一条模板链的subreads经过一致性校正，最终得到高准确度的HiFi reads，用于基因组组装。

三.优势

优势一无需扩增，不会人为的引入突变。

优势二超长读长，平均读长可达到10 Kb，最长读长可以达到40 Kb。

优势三覆盖均匀，无GC偏好性。

优势四通过reads的自我矫正，30X以上准确率能够达到99.999%。

优势五可以直接检测到甲基化信息，同步进行表观遗传学性别识别。

二.纳米孔测序技术

第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION，GridION X5 和 PromethION 三款不同类型测序仪。

一.基本原理

ONT测序的特点是单分子测序，测序读长长，测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等。Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。

二.相对于其他NGS测序平台的优势

1、碱基修饰的检测

它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。并且改方法的测序准确性可达99.8%，而且一旦发现测序错误也能较容易地进行纠正。

2、实时测序监控

对于临床实践，实时获取和分析DNA/RNA序列是一件很重要的事情。对于传统的NGS测序，做到这一点非常不易。但对于MinION，实现起来相对容易。这不仅是因为MinION体积小，易操作等，更是因为在测序过程中单分子穿过纳米孔，其电流变化可以检测并识别，这种设计允许用户在测序过程中根据实时结果做出一些判断。与在运行结束时批量交付数据的传统测序技术不同，纳米孔技术提供的是动态、实时的测序，支持在几分钟内就获得病原体鉴定等时间关键型应用的检测结果。用户可以在测序早期了解样本的质量和状态，也可以在获得足够的数据后停止测序。快速的采样到结果周转时间在未来感染性疾病、实地动态监测疫情爆发以及其它诊断方面具有巨大潜力。

3.长读长

读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端;数据可实时读取;通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成);起始DNA在测序过程中不被破坏;以及样品制备简单又便宜。理论上，它也能直接测序RNA。