从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。pacbio的三代测序技术高保真模式下的准确度已经能够和illumina二代测序技术的准确度相媲美，NanoPore开发的便携式测序仪随着其准确度不断的提高未来将会颠覆测序市场。测序仪的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。

一代测序（sanger测序法、双脱氧法测序）

原理：在4个DNA合成反应体系(含dNTP)中分别加入一定比例带有标记的ddNTP(分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP)，由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

一.双脱氧核苷酸

ABI公司根据双脱氧法进一步开发出荧光标记的双脱氧法测序试剂盒即BigDyeTM试剂再结合毛细管电泳生产出ABI 3730和 ABI 3500等测序仪。ABI3730可测序长度一般为700bp以上，ABI3500可测序长度一般为850bp以上。

双脱氧法测序的第一个核心技术就是在用DNA聚合酶合成DNA链的过程中掺入荧光基团标记的双脱氧核苷酸（ddNTP），双脱氧核苷酸是用化学合成的方法合成出3位’没有羟基的核苷酸。双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂。天然DNA组成元件是单脱氧核苷酸（dNTP），其糖基的3’和5’位各有一个羟基，5’位的羟基连接到上游的磷酸基团，不断重复，形成一条DNA骨架链。

二.测序步骤：

第一步：加入bigdye试剂（包含四种带荧光标记的ddNTP、四种dNTP、DNA聚合酶、镁离子、ph缓冲液等。）进行聚合反应。

实际测序过程中先在反应体系中加入要测序的DNA模板，一般是经过纯化的质粒，或者经过纯化好的PCR扩增片段，再加入与测序起始位置相互补的测序引物DNA，（引物的作用是与模板的特定序列位置相结合，引导聚合反应发生，同时确保DNA聚合反应从已知的、确定的起点开始）。

延伸反应由4个反应系统组成，每个反应系统加入四种不同的脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)和四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止。dNTP可以正常合成DNA；由于体系中同时含有ddNTP，ddNTP随机整合到产物链上，ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，得到一系列不同长短的DNA片段，每个片段的3’末端都是一个双脱氧的核苷酸残基。