原始数据下载地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50177

一.SRA数据下载

打开网页按以下步骤进行

将连接复制到迅雷下载，可以淘宝临时买个会员下载，速度较快，建议使用该方式下载。

也可复制地址用wget下载，速度贼慢，不建议。

1	wget https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos1/sra-pub-run-5/SRR957677/SRR957677.1

数据下载后通过xftp上传到服务器

二.使用sratoolkit从sra文件提取fastq文件

1	fastq-dump --gzip --split-files SRR957677 #从SRR957677分别提取左端和右端reads

–gzip 生成压缩格式为gz的fastq文件

SRR957677是一个PE测序结果，所以，需要–split-files参数可以将其分解为两个fastq文件。如果不加该参数，则只有1个fastq文件（包含了两端测序的结果）

有四个文件分别是SRR957677，SRR957678，SRR957679，SRR957680,；可以一个一个地提取fastq文件，也可以批量提取，有多种方法批量提取。

1）for循环

检查当前文件夹是否有SRR文件，*是匹配任意字符

ls SRR*

检查循环是否正确，echo打印出脚本

1	for i in `ls SRR*`;do echo fastq-dump --gzip --split-files $i ;done

将上述命令中的echo去掉直接运行即可

1	for i in `ls SRR*`;do fastq-dump --gzip --split-files $i ;done

2）while循环

新建文件列表这里命名SRR_list

1	ls SRR* >SRR_list

查看文件列表是否正确

1	cat SRR_list

检查循环是否正确，echo打印出脚本

1	cat SRR_list \| while read id;do echo fastq-dump --gzip --split-files $id ;done

或者

1	ls SRR95* \| while read id;do echo fastq-dump --gzip --split-files $id ;done#这里改为SRR95是因为当前有个文件名为SRR_list,如果还是SRR则会把这个文件也匹配进去

3)xargs

1	ls SRR95* \| xargs -i echo echo fastq-dump --gzip --split-files {}

4)awk

1	awk '{print "nohup fastq-dump --gzip --split-files "$0 " &"}' SRR_list >fastq_dump.sh

加nohup & 是为了放后台，因为每一个子命令都有nohup &所以这些命令是并行，>fastq_dump.sh是将命令写入fastq_dump.sh中。

1	bash fastq_dump.sh

查看命令是否挂后台，top查看进程，-u 参数接用户名

1	top -u liyue

可以看到有四个fastq-dump命令运行中

还可以使用其他命令查询

1	ps -aux \| grep "fastq_dump"

注意以上命令有个小问题，-split-files参数可以不加，因为这些测序文件是单端测序，所以即使加了该参数也只有一个fastq文件生成，如果是双端测序则会生成左端，右端两个fastq文件,不过加了也没影响

生成以下fastq文件

三.质控

1.质控使用fastqc软件

该软件可直接用conda安装，这里使用循环进行质控

1	ls *fastq.gz \| awk '{print "nohup fastqc " $0 " &"}' >fastqc.sh

运行fastqc.sh脚本

1	bash fastqc.sh

每个fastq文件质控后生一个html和zip压缩格式文件，html可下载到本地用浏览器打开

2.multiqc

可以将当前各个fastqz文件的质控报告综合到一起，生成一个总的html命令multiqc接fastqc结果文件所在地址

1	multiqc ./

生成结果文件为multiqc_report.html，html可下载到本地用浏览器打开

3.去除低质量碱基

1.fastp

fastp去除低质量碱基的同时可以自动识别接头

单端测序：fastp -i 输入文件 -o 输出文件

双端测序：fastp - i reads1 -I reads2 -o reads1输出文件 -O reads2输出文件

ls *fastq.gz >fastq_list#生成fastq列表
ls *fastq.gz | xargs -i basename {} .1_1.fastq.gz#获得fastq.gz文件的前缀
ls *fastq.gz | xargs -i basename {} .1_1.fastq.gz | paste fastq_list - #生成第一列是fastq文件名，第二列是对应的前缀名
ls *fastq.gz | xargs -i basename {} .1_1.fastq.gz | paste fastq_list - | awk '{print "nohup fastp -i "$1" -o "$2 "_clean.fastq.gz &" }' >fastp.sh #在前一步的基础上用awk生成fastp脚本
bash fastp.sh#运行脚本

2.trim-galore

trim_galore [options] <filename>
--quality<int>  #设定phred quality阈值。默认20（99%的read质量），如果测序深度较深，可以设定25
--phred33       #设定记分方式，代表Q+33=ASCII码的方式来记分方式。这是默认值。
--paired          # 对于双端结果，一对reads中若一个read因为质量或其他原因被抛弃，则对应的另一个read也抛弃。
--output_dir   #输出目录，需确保路径存在并可以访问
--length        #设定长度阈值，小于此长度会被抛弃。这里测序长度是100我设定来75，感觉有点浪费
--strency     #设定可以忍受的前后adapter重叠的碱基数，默认是1。不是很明白这个参数的意义
-e<ERROR rate>  #设定默认质量控制数，默认是0.1，即ERROR rate大于10%的read 会被舍弃，如果添加来--paired参数则会舍弃一对reads
<filename>  #如果是采用illumina双端测序的测序文件，应该同时输入两个文件。

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trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 20 -e 0.1 \
            --paired $dir/cmp/01raw_data/$fq1 $dir/cmp/01raw_data/$fq2  \
            --gzip -o $input_data #双端测序

3.fastqc

再次用fastqc检测碱基质量，并与去除低质量碱基前的fastqc结果进行对比

zero

RNA-seq第一部分（原始数据下载，提取fastq文件，fastqc质控）